《食品科学》：福建农林大学郭泽镔教授等：莲子分离蛋白乳液荷载β-胡萝卜素的稳定性与消化性

  β-胡萝卜素具有不稳定性结构与高度脂溶性，对光、热、金属离子等敏感且不溶于水，在食物基质中释放不完全以及在消化过程中有潜在降解，使其生物利用度仅为4%～14%。为克服β-胡萝卜素等亲脂性活性成分水溶性与稳定性差这一缺陷，拥有高比表面积的O/W型乳液已被大范围的使用在保护此类营养素，并调控营养素在消化过程中的生物学效价。

  蛋白质作为天然双亲性（亲水、亲油）生物大分子，因其良好的乳化活性，可用于形成和稳定O/W型乳液。相比大豆与小麦蛋白，明莲子分离蛋白（LSPI）因其独特的氨基酸组成与分子结构使其具有亲水与亲油平衡性，从而奠定了LSPI可在不经过改性处理的前提下拥有较好的界面性质。

  福建农林大学食品科学学院的孙乾、郑晓亮、郭泽镔*等通过模拟体外胃肠道消化模型，探讨 β- 胡萝卜素油相分散液（不被蛋白质乳化剂荷载）、LSPI与 β- 胡萝卜素复合乳液在消化过程中的物理性与化学性变化及其对 β- 胡萝卜素生物利用率的影响规律，旨在为制备高内相（高载量）活性物质的乳液体系构建提供指导。

  β-胡萝卜素乳液的贮藏稳定性被评估为模拟食品的保质期。由图1可知，温度高于25 ℃时乳液体系中油相液滴热运动加剧，紧密堆积的液滴逐渐分散，共聚焦激光扫描电子显微镜图片与液滴尺寸测量发现部分油滴增大且Zeta电位值明显上升。贮藏10 d后含有β-胡萝卜素的油相逐渐析出，此时Zeta电位绝对值明显减小，液滴尺寸明显增大直至乳液体系失稳，静电排斥力降低和絮凝程度的弱化是根本原因。然而，LSPI-BC在4 ℃贮藏时外观形貌、液滴尺寸与Zeta电位值均无显著变化，说明乳液体系在低温度的环境时油相液滴间的相互碰撞频率降低，提高乳液的贮藏稳定性。此外，25 ℃与35 ℃环境下β-胡萝卜素保留率分别保持在70%与45%以上，而4 ℃时β-胡萝卜素保留率保持在85%以上，说明LSPI对β-胡萝卜素荷载有显著保护作用。乳液物理稳定性越好，β-胡萝卜素降解越慢，不同贮藏温度与贮藏期对乳液中β-胡萝卜素的保护具有协同作用。对比Tan Huan等研究中的胺化明胶稳定玉米油乳液体系，4 ℃贮藏时β-胡萝卜素保留率大于50%（30 d），而35 ℃时仅为20%，表明LSPI荷载活性物质更具优势，甚至超越了它们。另外，发现4 ℃贮藏时LSPI-BC稳定性超越3 个月。这些根据结果得出，温度可有效改变乳液的物理化学稳定性及β-胡萝卜素的降解，适当的低温更有助于延长β-胡萝卜素乳液保存。

  由图2所示，β-胡萝卜素属热敏性活性物质，热处理初期阶段保留率缓慢下降，大于30 min时保留率显著下降至（65.13±8.17）%（50 ℃、180 min）、（35.34±4.57）%（100 ℃、180 min）。β-胡萝卜素受热时先氧化再降解，此外，衰减曲线也证明了更高的温度可导致β-胡萝卜素消减更快。然而，虽然随着热处理进行Zeta电位值略有上升，液滴尺寸为单峰分布且在120 min后略有增大，但是共聚焦激光扫描电子显微镜显示了乳液微观结构依然完整，赋予了LSPI-BC较好的耐热性，β-胡萝卜素免于更多的降解。这表明热处理迫使LSPI展开并暴露被埋藏的疏水基团，更多的非共价或共价（二硫键）结合位点暴露，在油相液滴表明产生空间网络结构，防止脂肪滴在热处理过程中絮凝。这可能与LSPI相比来说较高的耐热性有关（LSPI热变性温度为70.10 ℃），与其他蛋白质与多糖等复合物包埋稳定活性物质相比，LSPI具有天然单分子蛋白的独特优势。

  口腔消化阶段LSPI-BC的乳液表征如图3所示。液滴尺寸对消化以及生物活性物质吸收有及其重要的作用，更小的粒径拥有更大的比表面积促使与酶紧密接触，提高脂溶性活性物质平衡溶解度。乳液粒径、稳定状态通常直接或间接影响消化速率，且乳液初始液粒径直接影响后续消化过程与生物利用度，乳液粒径增加且消化产物形成胶束速率降低，导致油脂水解速率降低。

  在口腔消化阶段，唾液黏蛋白是模拟口腔液中主要消化成分，高度糖化的蛋白质在消化过程中具有上消化道润滑与分散脂肪等作用。由图3a可知，液滴尺寸增大并由单峰转为多峰分布，共聚焦激光扫描电子显微镜观测乳液在口腔消化中出现聚集，这可能是由于黏蛋白促使乳液间产生桥联絮凝。另外，口腔液中含有多种离子成分并在乳液界面引发静电屏蔽效应，促使液滴尺寸增加，导致乳液聚集与稳定性下降。消化液Zeta电位值随着消化时间由－44.56 mV降至－19.22 mV，表明含有唾液黏蛋白与高浓度离子的口腔消化液降低了液滴表面带电性与带电量并影响乳液稳定性。

  由图4可知，LSPI-BC的初始pH值在7.0附近，随着消化时间延长，模拟胃液中pH值逐渐下降，消化至60 min时达到稳定状态，此时pH值在2.0附近。胃液中pH值变化可影响胃蛋白酶活性并进一步影响胃部消化进程，而胃蛋白酶在较高pH值环境下（pH＞6.0）活性较低，因而pH值的下降速率从侧面反映了蛋白质作为乳化剂所抵御pH值变化的能力。LSPI-BC在胃液中的pH值下降速率比乳清蛋白更慢，结合前期研究分析，这可能与LSPI中含有较多谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸（疏水结构）有关。此外，相比于大豆蛋白（24.5%）、乳清蛋白（26.1%），LSPI中疏水性氨基酸占比35%，具有更稳定的蛋白质结构。

  乳液表面电位与离子间静电排斥力呈正相关，是维持乳液稳定的主要作用力之一。由图5可知，胃消化初期pH值降低导致Zeta电位趋于正值，液滴尺寸发生跃升，对比图4可发现偏酸性时，胃蛋白酶水解油-水界面LSPI分子，液滴间静电排斥力减弱，乳液形成状态主要为絮凝或相互聚集产生的“桥联”，降低了乳液整体稳定性。然而，随着消化过程中pH值不断降低，Zeta电位为正值并逐渐升高至20 mV左右，蛋白质聚集体逐渐分散，消化至90～120 min时液滴尺寸几乎恢复至消化初始（28.57 μm），说明静电排斥力变化是导致LSPI-BC聚集与解聚集的根本原因之一。

  由图6可知，胃消化阶段时消化液稀释导致体系中β-胡萝卜素质量浓度降低，β-胡萝卜素质量浓度为初始值的68.9%，肠消化阶段时β-胡萝卜素质量浓度仅为15.4%，油相被水解后部分β-胡萝卜素暴露在消化液中受到酸性等环境影响。然而，消化液DPPH自由基清除能力不与消化液中β-胡萝卜素质量浓度呈正比并明显高于初始值。有研究表明，LSPI本身也具有抗氧化性，不一样的种类的酶对莲子蛋白水解改性后酶解产物的还原能力高出LSPI近3 倍，说明经水解后其抗氧化能力得到非常明显提升。肠消化阶段抗氧化性迅速降低，这与添加小肠消化液稀释作用以及抗氧化性多肽的水解有关。

  LSPI-BC由胃消化阶段进入肠消化阶段时，pH值由强酸性（pH 2.0左右）转为中性（pH 7.0～7.5）。由图7所示，肠消化初期液滴尺寸下降至11.72 μm，界面处LSPI分子逐渐被水解并释放油相。然而，在肠消化后期液滴尺寸一直上升（180 min时为32.23 μm），肠液中胆汁盐逐渐取代界面处LSPI分子，同时LSPI分子被水解为小肽。脂肪酸与单甘酯作为表面活性物质在消化中逐渐被释放并吸附或堆积在液滴表面。共聚焦激光扫描电子显微镜观察到LSPI-BC被立即分散成细小液滴且数量减少，说明油相液滴被胰脂肪酶分解，体系中只有少量被染色的混合胶束，其余为长链脂肪酸、钙离子形成的钙皂等物质，因而增加了肠消化后期液滴尺寸大小。此外，肠消化阶段NaHCO 3 不断中和H ＋ 并促使pH值稳定（pH 7.0～7.5），LSPI被水解后带负电荷，表现为消化液Zeta电位绝对值明显增大，由消化初期11.37 mV（0 min）迅速降至－47.73 mV（30 min）。对比LSPI水溶液、LSPI乳液、LSPI-BC与其消化60 min时的电位值（－21.69、－44.10、－41.43、－51.55 mV）（pH 7.0），说明胆汁盐可快速吸附并取代油相液滴表面的LSPI分子。另外，电位负值增加表明油脂逐渐被消化并释放出游离脂肪酸，一部分黏附在油相液滴表面与油相液滴表面残留的少量蛋白质（乳化剂）产生竞争性吸附，一部分与胆汁盐、磷脂等表面活性剂结合并形成混合胶束增加负电荷形成。

  由图8可知，肠消化初始游离脂肪酸释放接近最大释放量，胰脂肪酶在胆汁盐介导作用下附着在油相液滴表面并高效水解油脂，水解产物（如游离脂肪酸、尿酸双乙酰胆碱）与消化液中离子形成盐类并不断被溶解。消化30～40 min时游离脂肪酸释放量增加缓慢，60 min后游离脂肪酸趋于稳定，此时游离脂肪酸释放量达到（61.94±6.26）%，这是因为油脂分解产生脂肪酸不断堆积在界面处，同时减小与脂肪酶接触。这种“酶解-转移-溶解”效应随消化时间而达到动态平衡，表现为脂解速率逐渐降低。此外，游离脂肪酸释放速率减缓也可以解释为LSPI-BC在肠消化后期空间位阻相对增大，抑制脂肪酶在乳液界面处的稳定性，因而解释了上述肠消化时液滴尺寸相比胃消化时不断减小。

  此外，对不同时间点游离脂肪酸释放率进行一阶动力学曲线拟合，得到曲线，一阶动力学方程为y＝－0.690 5x＋0.339 6，一阶动力学常数为－0.690 5。

  β-胡萝卜素体外消化多采用胶束化率作为评价生物利用度的重要指标。由表1可知，肠消化阶段时LSPI-BC中β-胡萝卜素释放率达到（71.84±5.55）%，此时LSPIBC中尚有未消化且液滴尺寸较小的油相液滴（图7a），脂肪酶接触油相液滴的界面面积较小，促进脂肪酶进入油相液滴表面。然而，较大的油相液滴需要更长时间被水解，阻碍β-胡萝卜素释放，在酸性介质中保持活性物质的稳定性，延迟体外消化阶段活性物质释放并提高生物利用率（（58.51±7.56）%）。前期研究表明，LSPI富含谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸与异亮氨酸，疏水性氨基酸相对含量为34.62%，疏水性产生的空间位阻效应可干扰油脂水解，减缓β-胡萝卜素在油相液滴中释放。油相液滴在肠液消化阶段被胰脂肪酶酶解生成游离脂肪酸时，β-胡萝卜素同时被释放并与游离脂肪酸、胆汁盐、单甘油酯等物质相互作用生成混合胶束，胶束以水相为载体并通过小肠上皮细胞组织进入血液循环被吸收利用，油脂水解程度与混合胶束生成相关，混合胶束减少则β-胡萝卜素生物可利用率下降。这些结果说明，由LSPI构建高内相（高载量）乳液可实现包埋、递送、缓释活性物质（β-胡萝卜素）的作用，这为丰富植物基蛋白应用与膳食营养结构的多元化提供了借鉴。

  以LSPI为天然乳化剂制备荷载β-胡萝卜素的复合乳液，分析贮藏与热处理对LSPI-BC稳定性与保留率的影响，通过构建体外胃肠道消化模型，探讨LSPI-BC在胃肠道不同消化阶段的变化规律，以及DPPH自由基清除率、游离脂肪酸、生物利用率在不同消化阶段的变化。根据结果得出：贮藏温度上升导致LSPI-BC体系崩溃以及β-胡萝卜素降解显著加快。高温处理促使LSPI热变性，形成空间网络结构稳定乳液体系并减缓β-胡萝卜素损失。此外，口腔消化时唾液黏蛋白与高浓度离子作用，液滴尺寸先增大后减小，黏蛋白与LSPI共同吸附保持了LSPI-BC稳定；乳液随唾液酶进入胃液消化时强酸环境诱使pH值下降，界面静电屏蔽作用降低，桥联絮凝引发的聚集作用破坏了乳液稳定性，在胃酶（胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等）与胃蠕动作用下溶解和释放油脂并转移至小肠；肠液消化时，胰脂肪酶水解蛋白质生成小肽或氨基酸，在胆汁盐作用下和胰脂肪酶水解油相液滴并释放游离脂肪酸，LSPI包埋作用延迟体外消化阶段活性物质释放并提高β-胡萝卜素生物利用率（58.51%），这为LSPI的应用提供了广阔空间。

  本文《莲子分离蛋白乳液荷载β-胡萝卜素的稳定性与消化性》来源于《食品科学》2023年44卷第10期46-55页，作者：孙乾，郑晓亮，王建一，郭泽镔。DOI:10.7506/spkx0831-369。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

  实习编辑：云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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